荧光探针法和疏水相互作用层析法分析蛋白表面疏水性

【摘要】蛋白表面疏水性是蛋白质的重要特性之一,对于维持蛋白质的稳定构象及生物活性有着重要作用,同时又是疏水作用为主的层析分离蛋白质方法的重要依据。了解蛋白质在不同条件下表面疏水特性的变化,有助于理解其结构变化和生理活性,对于优化蛋白分离过程也有指导意义。本文利用荧光探针法和疏水相互作用层析(HIC)法,探究不同因素对蛋白表面疏水性的影响,得到一些规律性认识。主要结果如下：首先以8-苯氨基-1-萘磺酸铵盐(ANS)为荧光探针,优选了测定体系的pH值和ANS浓度,测定蛋白质的表面疏水性指数S0,考察了温度、盐、变性剂、辛酸钠(NaCA)等对牛血清白蛋白(BSA)、牛免疫球蛋白(bIgG)So的影响。发现温度对BSA和bIgG表面疏水性的影响呈现相反的规律。不同盐对蛋白表面疏水性的影响与相关离子的Hofmeister序列位置相关,稳液盐和中性盐存在时蛋白质的S0值大于离液盐条件下的S0值。BSA和bIgG的表面疏水性受十二烷基磺酸钠(SDS)的影响存在较大差异。盐酸胍浓度升高,BSA的S0值明显减小,而bIgG的S0值先增大后减小。NaCA浓度提高,BSA的S0值逐渐减小,而bIgG的S0值则几乎没有变化。运用荧光光谱法进一步分析荧光探针-蛋白质的结合作用,比较多种数据处理方法。结果表明,Scatchard非线性方程适合分析BSA-ANS及IgG-ANS体系,获得结合位点数分别为5.8和10.7,结合常数分别为3.37×106M-1和3.34×104M-1。利用Adair公式分析BSA-ANS体系,不仅获得结合位点数5,还可得到各位点相应的结合常数。采用疏水相互作用层析法,以PhenylSepharose6FF为层析介质,选取牛血清白蛋白(BSA)、牛免疫球蛋白(bIgG)和溶菌酶为模型蛋白,测定不同条件下蛋白的容量因子k’,表征蛋白的表面疏水性变化。发现三种蛋白质的lnk’随着(NH4)2SO4和NaCl浓度升高而增大,随NaSCN浓度增大而减小。基于优先相互作用理论计算得到的三种蛋白质在稳液盐(NH4)2SO4和中性盐NaCl存在时的水分子释放数为正值,而离液盐NaSCN条件下,水分子释放数为负值。相同浓度Na2SO4、(NH4)2SO4NaCl、NH4Cl及NaSCN溶液,BSA和bIgG对应的k’依次减小。pH在3-8范围内,对于BSA和溶菌酶,pH值越接近等电点,k’值越大,而bIgG的k’值则随pH的升高而增大。三种蛋白质的k’值受盐酸胍浓度影响的整体趋势相同,均随盐酸胍浓度的升高而减小。辛酸钠浓度从0升高至75mM,BSA的k’值先减小后增大,而bIgG的k’值则保持在1.7左右。随着乙醇添加量的增大,三种蛋白质的k’值均不断减小。比较荧光探针法测定的S0和疏水相互作用层析法测得的k’,发现二者具有较好的相关性。不同NaCl、(NH4)2SO4浓度以及不同盐类存在时,BSA和bIgG的S0能与容量因子较好地对应。BSA的S0随盐酸胍浓度的变化情况与k’值的变化一致。保持辛酸钠/蛋白质的浓度比相同,荧光探针法测得的辛酸钠浓度0～4.5mM范围内的S0值与辛酸钠浓度为0～50mM时BSA的k’值变化规律相同。结果表明,荧光探针测定的蛋白质在不同溶液中的表面疏水性指数在一定程度上可以预测蛋白质在疏水层析柱上的保留行为。本文利用荧光探针法和疏水相互作用层析法考察了不同因素对蛋白表面疏水性的影响,得到了一些规律性的认识。一方面充分了解蛋白质的表面疏水特性,有助于提高蛋白质的稳定性,为蛋白质的贮存和配方优化提供指导；另一方面,对于疏水结合起主导作用的疏水相互作用层析和疏水性电荷诱导层析等蛋白分离过程,表面疏水性信息有助于预测蛋白质的保留行为,改善分离过程,提高分离效率。
【作者】余晶梅；
【导师】林东强；
【作者基本信息】浙江大学，生物化工，2014，硕士
【关键词】蛋白质；表面疏水性；荧光探针；表面疏水性指数；疏水相互作用层析；容量因子；

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